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Manipulation de MGM en milieu scolaire
publication le 20/11/2016

Mots clefs : utilisations manipulations OGM MGM génétiquement modifiés organismes genetiquement modifies matériel génétique milieu confiné agréments agrements declaration déclaration enseignements travaux pratiques lycées lycees section STS BTS haut conseil biotechnologies scolaire

Manipulation de MGM en établissement scolaire


Sommaire de la fiche


  1. Définitions
  2. Champ d'application de la législation relative à l'utilisation confinée des OGM
  3. Critères d'évaluation des risques
  4. Description des niveaux de confinement 1 et 2 pour les OGM
  5. Traitement des déchets issus de la production et/ou utilisation d'OGM.

Les établissements scolaires qui manipulent des microorganismes génétiquement modifiés (MGM) sont tenus d’établir une Déclaration d’Utilisation d’OGM ou une demande d’agrément auprès du ministère de l'éducation national et de l’enseignement supérieur et de la recherche. Comme les agents biologiques naturels, les MGM sont classés en 4 groupes, en fonction des risques qu’ils présentent pour la santé publique ou pour l’environnement. Chaque groupe définit la classe de confinement dans laquelle l’OGM doit être manipulé.

La présente synthèse se limitera aux bactéries génétiquement modifiées dans le cadre des manipulations au programme des BTS Biotechnologies et Bioanalyses et contrôles. Elle se limitera donc à la description des classes de confinements 1 et 2. En effet, les laboratoires d'enseignement en section de technicien supérieur ont, au maximum, un niveau de confinement 2, il est donc interdit d'y manipuler des agents biologiques de groupe de danger supérieur à II. De plus, pour manipuler des OGM de groupe II, le confinement du laboratoire doit également répondre aux exigences spécifiques pour la manipulation des OGM (pararagraphe 4).

Les étapes de la classification des OGM utilisés peuvent être schématisées de la manière suivante :

classification des MGM

1. Définitions

D'après la loi 2008-595 et la directive 2009/41/CE, porte le nom de :

  • « Organisme : toute entité biologique non cellulaire, cellulaire ou multicellulaire, capable de se reproduire ou de transférer du matériel génétique ; cette définition englobe les micro-organismes, y compris les virus, les viroïdes et les cultures de cellules végétales et animales ;
  • « Organisme génétiquement modifié : organisme dont le matériel génétique a été modifié autrement que par multiplication ou recombinaison naturelles ; »

L’utilisation de molécules nues d’acides nucléiques comprenant un élément susceptible de réplication ou permettant l’obtention d’un organisme génétiquement modifié peut relever de la législation sur les OGM si les qualités ou les quantités des séquences manipulées permettent un transfert vers des organismes récepteurs. De telles molécules présentent un danger potentiel ce qui nécessite une évaluation du risque.

2. Champ d'application de la législation relative à l'utilisation confinée des OGM

2.1. Techniques entrant dans la champ d'application

Ce sont les techniques de modification génétique visées à l’article D. 531-1 du Code de l'environnement et qui comprennent notamment :

  • Les techniques de recombinaison de l'acide nucléique impliquant la formation de nouvelles combinaisons de matériel génétiques par l'insertion de molécules d'acides nucléiques dans un plasmide bactérien ou dans tout autre système vecteur, et leur incorporation dans un organisme hôte dans lequel elles ne sont pas présentes à l'état naturel mais dans lequel elles peuvent se multiplier de façon continue.
  • Les techniques impliquant l'incorporation directe dans un micro-organisme ou dans un organisme de matériaux héréditaires par micro-injection, électroporation ou l'utilisation de microprojectiles.

2.2. Exemples de manipulations qui ne sont pas considérées comme donnant lieu à une modification génétique, selon les termes du Code de l’environnement

Ne sont pas soumis aux dispositions sur les OGM, les organismes génétiquement modifiés obtenus par des techniques qui ne sont pas considérées, de par leur caractère naturel, comme entraînant une modification génétique ou par celles qui ont fait l'objet d'une utilisation traditionnelle sans inconvénient avéré pour la santé publique ou l'environnement. La liste de ces techniques est fixée par décret après avis du Haut Conseil des biotechnologies.

Les techniques suivantes, mentionnées à l'article D. 531-2 du Code de l'environnement ne sont pas considérées comme donnant lieu à une modification génétique:

  • « - la fécondation in vitro ;
  • - les processus naturels tels que la conjugaison, la transduction ou la transformation ;
  • - l’induction polyploïde ;
  • - à condition qu'elles n'impliquent pas l'utilisation d'organismes génétiquement modifiés en tant qu'organismes récepteurs ou parentaux :
    • - la mutagénèse ;
    • - la fusion cellulaire, y compris la fusion de protoplastes, de cellules de n’importe quelle espèce eucaryote, y compris d’hybridomes, et les fusions de cellules végétales d’organismes qui peuvent échanger du matériel génétique par des méthodes de sélection traditionnelles ;
    • - l’infection de cellules vivantes par les virus, viroïdes ou prions ;
    • - l'autoclonage, qui consiste en la suppression de séquences de l'acide nucléique dans une cellule d'un organisme, suivie ou non de la réinsertion de tout ou partie de cet acide nucléique ou d'un équivalent synthétique, avec ou sans étapes mécaniques ou enzymatiques préalables, dans des cellules de la même espèce ou dans des cellules d'espèces étroitement liées du point de vue phylogénétique qui peuvent échanger du matériel génétique par le biais de processus physiologiques naturels, si le micro-organisme qui en résulte ne risque pas de causer des maladies et s'il est utilisé en milieu confiné. L'autoclonage peut comporter l'utilisation des vecteurs recombinants dont une longue expérience a montré que leur utilisation dans les micro-organismes concernés était sans danger. »

Pour qu’un micro-organisme puisse être considéré comme résultant d’une opération d’autoclonage, le HCB devra obligatoirement être consulté et une demande de classement devra lui être adressée. Seuls les micro-organismes receveurs de classe 1 sont concernés par l’autoclonage.

3. Critères d'évaluation des risques

3.1. Critère de détermination du danger

L’évaluation du danger d’un OGM doit prendre en compte le danger de chacun des éléments du trinôme qui composent un MGM :

  • insert,
  • vecteur,
  • organisme receveur.

Dans le cas où les niveaux de risque sont différents pour le receveur, le vecteur et l'insert, il convient de retenir le risque le plus élevé. Cependant, l’organisme résultant de l’assemblage de ces éléments peut parfois présenter un danger supérieur ou inférieur à celui du plus dangereux des composants du trinôme.

Insert
La séquence insérée, si elle ne peut pas être un facteur de danger, est dite de catégorie A.
Elle appartient à la catégorie B si elle peut être un facteur de danger, il peut s'agir par exemple :

  • d'ADN codant pour une protéine biologiquement pathogène (toxine...),
  • d'ADN issu d’un micro-organisme pathogène,
  • d'ADN dont l’expression est directement liée au mécanisme d’immortalisation des cellules ou capable d’augmenter la capacité d’expression, d’intégration et/ou de réplication du vecteur.
Le HCB a établi une liste indicative et non exhaustive d’exemples de séquences de catégorie B.

Vecteur
Certains vecteurs, tels que ceux dérivés de virus peuvent présenter un danger en raison de leur capacité à être intégrés dans le génome de la cellule hôte.
D’autres sont dangereux en raison de leur pathogénicité, de leur capacité à se recombiner avec ou à être complémentés par des virus endogènes de l’hôte.
Les exemples choisis ne seront que des vecteurs procaryotes.
Si les vecteurs phagiques et plasmidiques “ classiques ” tels que ceux qui dérivent du phage lambda ou du plasmide pBR322 ne posent généralement pas de problèmes, il en va tout autrement des constructions de plus en plus complexes qui intègrent des séquences non procaryotes ou qui conduisent à la formation de différents types de vecteurs navettes.
Par conséquent, le HCB insiste pour que les pétitionnaires fournissent une documentation détaillée de la structure des vecteurs utilisés lors de la demande d’agrément afin de pouvoir évaluer le niveau de risque des constructions.
Une attention particulière doit être portée sur la capacité ou non du vecteur à exprimer l'insert dans l'organisme receveur.

Organisme receveur
Dans le cas de l'utilisation de bactéries comme organisme receveur, c'est le groupe de danger de la bactérie receveuse qui sera pris en compte si elle n'a subi aucune modification génétique préalable.
Si la bactérie receveuse est elle-même modifiée, il y aura une détermination du danger en fonction des modifications.
Par exemple, un organisme receveur non pathogène peut présenter un danger après l’introduction d’une séquence exogène qui :

  • peut permettre l’expression d’une toxine,
  • peut modifier les caractéristiques du receveur (augmentation de la prolifération ou de la survie dans l’environnement).

OGM résultant
D’une façon générale, pour déterminer le niveau de danger présenté par un organisme génétiquement modifié par un intermédiaire de construction, le HCB tient compte de la nature de l’organisme receveur et évalue si le vecteur et la séquence clonée introduite modifient le niveau de danger présenté par cet organisme receveur.
Le groupe de risque de l’OGM est donc fonction du groupe de risque de chacun des éléments mis en œuvre et doit correspondre généralement au groupe de risque le plus élevé mais pas systématiquement.
Par exemple, la combinaison d’une séquence de catégorie B dans un vecteur viral de groupe de risque 2 peut aboutir à un organisme recombinant présentant un danger potentiel de risque 3 supérieur à celui du vecteur et du gène considérés séparément. A contrario, la combinaison d'une séquence de catégorie B (gène de virulence) dans un vecteur plasmidique qui n'est pas un vecteur d'expression et d'un organisme receveur de groupe 1 peut aboutir à un organisme recombinant présentant un danger potentiel de risque 1 inférieur à celui de l'insert dans la mesure où l'organisme recombinant n'est pas susceptible d'exprimer le gène de virulence et n'aura pas son phénotype modifié.

Selon l’article D. 532-2 du Code de l’environnement, les organismes, en particulier les micro-organismes, génétiquement modifiés sont classés en quatre groupes distincts en fonction des risques qu'ils présentent pour la santé publique ou l'environnement, et notamment de leur pathogénicité.

Groupe I Groupe II Groupe III Groupe IV
Possibilité de provoquer une maladie chez l’homme, les animaux et les végétaux ou causer un effet négatif sur l'environnement non * oui oui oui
Danger pour les travailleurs - oui oui oui
Propagation dans la collectivité - peu probable possible élevé
Existence d’une prophylaxie ou d’un traitement efficace - oui oui non

*non pour l'organisme receveur, non pour le vecteur qui ne doit pas pouvoir modifier le phénotype du receveur en ce sens et non pour l'OGM

3.2. Principe de la détermination des risques et des niveaux de confinement

Les risques liés aux OGM dépendent de deux facteurs :

  • les dangers propres des OGM tels que définis dans le paragraphe précédent,
  • les modalités de leur mise en œuvre (construction, utilisation finale).
L’évaluation de la probabilité qu’un danger potentiel devienne effectif détermine le niveau de risque.

Après la détermination de la classe de danger présenté par chaque élément du trinôme constitutif de la construction et de l’OGM lui-même, a lieu une évaluation des risques de chaque opération, en tenant compte des conditions de mise en œuvre de l’OGM lui-même et des intermédiaires de sa construction. Des exemples de procédures d'évaluation des dangers et des risques liés à l'utilisation d'OGM sont disponibles dans le chapitre 3 du manuel du HCB pour l'utilisation confinée d'OGM.

L’évaluation des risques permet au laboratoire de définir des moyens de maîtriser ces derniers, afin d’assurer la protection de l’homme, de l’animal et de l’environnement. La maîtrise des risques que présentent les OGM, leur construction et leur utilisation se fera essentiellement par des mesures de confinement spécifiques.
En fonction de leur groupe de risque défini ci-dessus, et des conditions de leur manipulation, l’article D532-3 du code de l’environnement définit quatre niveaux de confinement.

Classes de confinement 1
(C1)
2
(C2)
3
(C3)
4
(C4)
Manipulations utilisant des OGM de groupe I OGM de groupe II OGM de groupe III OGM de groupe IV
Manipulations dont le risque pour la santé humaine et l'environnement est nul ou négligeable faible modéré élevé

Ce classement s’applique à toutes les manipulations effectuées sur les micro-organismes en laboratoire.
Dans certains cas, les caractéristiques de la manipulation peuvent exiger un niveau de confinement différent de celui qu'entraîne ce classement. Par exemple, certaines étapes de la mise en œuvre d’OGM de groupe de risque III peuvent présenter des risques qui nécessitent un confinement de type C3 tandis que d’autres peuvent présenter des risques moindres nécessitant un confinement de type C2.

4. Description des niveaux de confinement 1 et 2 pour les OGM

Le confinement est établi par des systèmes de barrières physiques, chimiques ou biologiques. Peuvent être ainsi définis :

  • le confinement primaire qui constitue la première barrière physique entre la source de danger et l’opérateur (flacon de culture, Poste de Sécurité Microbiologique, etc.) ;
  • le confinement secondaire qui empêche la contamination de l’environnement en cas de rupture accidentelle du confinement primaire (laboratoires, animaleries ou serres).
Étant donné que la dissémination volontaire d’OGM, quel que soit l’usage (agricole, thérapeutique ou industriel) doit faire l’objet d’une autorisation, il importe d’éviter la fuite de toute séquence recombinée au cours de l’utilisation d’OGM, même de celles qui ne présentent pas de dangers tant lors de leur construction que pour leur mise en œuvre.
Le HCB recommande l’inactivation des déchets solides et des effluents par des procédures validées avant leur évacuation pour tous les niveaux de confinement, y compris le niveau C1.

Pour être efficace, le classement d'une manipulation de génie génétique doit s'accompagner du respect des conditions de confinement correspondantes. Ces conditions de confinement sont définies par la classification C1, C2, C3, C4. Cette classification intègre les quatre notions suivantes :

  • l'agencement du laboratoire ;
  • les équipements matériels du laboratoire ;
  • les équipements individuels de protection (EPI) ;
  • les bonnes pratiques de travail.
L’arrêté du 16 juillet 2007 dans ses Annexes I et V, ainsi que l'annexe IV de la directive 2009/41/CE du Parlement européen et du Conseil du 6 mai 2009 relative à l'utilisation confinée de micro-organismes génétiquement modifiés (Art. D532-3) définissent les mesures techniques générales et spécifiques de prévention et de confinement minimum à mettre en œuvre dans les laboratoires de recherche, de développement et d'enseignement où sont utilisés des agents biologiques pathogènes des groupes 2, 3 ou 4. Compte tenu des risques particuliers des OGM, les exigences des niveaux de confinement C1, C2, C3 et C4 sont, sur certains points, plus contraignantes que celles des niveaux de confinement des agents biologiques non modifiés.

Dans tous les cas, un exemplaire des règles à suivre à l'intérieur des locaux C2, C3, C4 doit être disponible à l'entrée de chaque laboratoire. Lorsque les expérimentations comportent la manipulation d'organismes biologiques pathogènes, les personnes directement impliquées dans la réalisation des expériences doivent être soumises à un traitement prophylactique approprié (vaccination, etc.), s’il existe, en accord avec le Médecin du Travail.
Des dispositifs permettant une inactivation immédiate des organismes biologiques manipulés doivent être disponibles dans chaque laboratoire. Les locaux doivent être maintenus propres et en ordre pour faciliter le respect des bonnes pratiques de travail. Seule une application intégrale et simultanée de toutes les normes de sécurité appropriées peut permettre une protection réelle des expérimentateurs, de l'environnement et du matériel biologique expérimental.
Il est donc important que les responsables des laboratoires s'assurent que l'ensemble des installations, les EPI et les bonnes pratiques de travail dans les laboratoires soient conformes aux niveaux du risque potentiel et du risque réel des expériences réalisées. Le personnel compétent techniquement reçoit une formation adaptée à la biosécurité.
Les systèmes ou appareillages de sécurité doivent faire l’objet de vérifications périodiques qui garantissent le maintien des performances dans le temps.

Seules les mesures de confinement imposées par les risques potentiels propres au génie génétique sont décrites ci-dessous et ne seront décrits que les conditions de confinement 1 et 2.

Autorisation d'un OGM de groupe II en labo d'enseignement

Confinement C1

  1. Pratiques de travail
    1. Les surfaces de travail sont nettoyées et désinfectées chaque jour et immédiatement après tout incident conduisant au déversement d'organismes contenant des molécules d'ADN recombinant.
    2. Tous les déchets biologiques et les fluides sont stérilisés (ou à défaut inactivés par des procédures validées) avant destruction ou rejet. Les matériels contaminés par des microorganismes génétiquement modifiés tels que la verrerie, les cages pour les animaux et les équipements de laboratoire doivent être décontaminés avant le lavage, le réemploi ou la destruction.
    3. Le matériel de pipetage mécanique doit être utilisé, le pipetage à la bouche est interdit.
    4. Les manipulations doivent être faites de manière à minimiser la création d'aérosols.
    5. Manger, boire, conserver des aliments, et toute activité qui n’est pas en lien avec l’expérimentation ne sont pas autorisés dans l'aire de travail.
    6. Le port d’une blouse, ou d’un vêtement spécifique de laboratoire est requis. Les vêtements de laboratoire ne sont pas portés en dehors du site.
    7. Le personnel doit se laver les mains après avoir été en contact avec des organismes contenant des molécules d'ADN recombinant et également quand il quitte le laboratoire.
  2. Équipement de confinement
    Un équipement spécial de confinement n'est pas requis au niveau C1.
  3. Agencement spécial du laboratoire
    Un modèle spécial de laboratoire n'est pas requis au niveau C1.

Confinement C2

  1. Pratiques de travail
    1. Les portes du laboratoire sont maintenues fermées pendant que les expériences sont en cours.
    2. Tous les déchets biologiques et les fluides sont inactivés par des procédures validées avant destruction ou rejet. Les matériels contaminés tels que verrerie, cage pour les animaux et équipement de laboratoire doivent être décontaminés avant le lavage, le réemploi ou la destruction.
    3. Des soins doivent être apportés pour minimiser la création d'aérosols. Par exemple, on évitera les manipulations telles que l'insertion d’une boucle ou d'une aiguille à inoculer chaude dans la culture, le flambage jusqu'à crépitement d'une boucle ou une aiguille à inoculer, et l'éjection sous pression des fluides des pipettes ou des seringues.
    4. Les déchets et matériels qui sont décontaminés hors de la zone C2 doivent être placés dans un conteneur résistant et étanche qui est fermé et désinfecté extérieurement avant le transport hors du laboratoire. Un système doit permettre d'identifier le conteneur et d'éviter son ouverture avant stérilisation. L'ensemble de l'opération fait l'objet d'une procédure écrite.
    5. Seules les personnes autorisées et qui ont été informées de la nature des recherches entreprises peuvent entrer dans le laboratoire.
    6. Le symbole international de biorisque doit être placé sur toutes les portes d'accès du laboratoire. Les congélateurs et réfrigérateurs utilisés pour mettre en dépôt des organismes contenant des molécules d'ADN recombinant doivent également comporter le symbole international de biorisque s'ils sont à l'extérieur du laboratoire.
    7. Un programme de contrôle des insectes et des rongeurs doit être institué.
    8. Les animaux et les plantes qui ne sont pas en relation avec l'expérience ne sont pas autorisés dans le laboratoire.
  2. Équipement de confinement
    Des postes de sécurité biologique seront utilisés pour contenir les équipements produisant des aérosols, tels que mélangeurs, lyophilisateurs, générateurs de son et centrifugeuses, sauf si le modèle de l'équipement fournit le confinement pour les aérosols potentiels. Par exemple, une centrifugeuse peut fonctionner à l'air libre si les tubes sont munis d'un couvercle étanche ou si les tubes sont placés dans une nacelle étanche pendant la centrifugation. Les tubes ou l’enceinte étanche sont ensuite transportés dans un PSM de type II pour être ouverts. Les manipulations qui comportent des risques potentiels de dispersion d’OGM sont effectuées sous des PSM de type II. Les PSM doivent être certifiés par le LNE (Laboratoire National d'Essai) et testés selon les normes en vigueur. Des gants sont portés par les utilisateurs pendant toute la durée des manipulations qui comportent des risques potentiels et ils sont décontaminés avant d’être jetés, immédiatement après la fin de ces manipulations.
  3. Agencement spécial du laboratoire
    La ventilation des salles dédiées aux activités techniques est assurée par un dispositif de ventilation mécanique, conformément à l’article R. 232-5-6 du code du travail.
    Un autoclave pour la stérilisation des déchets et des matériels contaminés doit être disponible à proximité du lieu où sont manipulés des OGM.
    Les conduites de vide doivent être protégées par des filtres afin de ne pas risquer de contaminer le système générateur de vide en cas de rupture de vide ou de reflux.
Les descriptions des confinements 3 et 4 sont disponibles dans l'annexe III.1 du manuel du HCB pour l'utilisation confinée d'OGM.

5- Traitement des déchets issus de la production et/ou utilisation d'OGM.

Sont décrites ici les mesures qui s'imposent dans les laboratoires d'enseignement pour l'utilisation d'OGM en confinement 1 et 2.
La destruction des déchets biologiques, même confiée à un prestataire de service, est sous la responsabilité du producteur des déchets jusqu’à son stade ultime. Dans la plupart des cas, la première étape du traitement des déchets issus de la production et/ou de l’utilisation d’OGM est l’inactivation des déchets sur le lieu de production ou d’utilisation. En l’absence de règles spécifiques aux OGM, une référence à la gestion des Déchets d'Activités de Soins à Risques Infectieux (DASRI) peut s’avérer pertinente.

Les directives suivantes doivent être considérées comme des guides : toute méthode alternative peut être proposée dès lors que son efficacité est démontrée.

Confinement C1

  • Le HCB recommande que les déchets, solides et liquides, soient inactivés pour stériliser l’OGM sur le site de production, par traitement physique ou chimique validé.
    Par exemple, un autoclavage à 134°C et 20-30 minutes de plateau de stérilisation dans un air saturé de vapeur d’eau. L’autoclave doit alors être situé sur le site (C1). Les objets piquants et coupants sont placés dans une boîte de sécurité inviolable et autoclavable.
    Tous les déchets solides sont mis dans un conteneur (sac) étanche, résistant et autoclavable, fermé de façon non hermétique par un ruban adhésif autoclavable.
    Le conteneur est étiqueté (laboratoire, équipe, date).
    Pour les déchets liquides qui ne pourraient pas être autoclavés, il est par exemple possible d’utiliser de l’hypochlorite de sodium (eau de javel) à 0,43% de chlore actif final en contact pendant 12 h minimum.
    D’autres traitements validés peuvent être utilisés sous l’entière responsabilité des opérateurs. Leur utilisation devra être détaillée dans le dossier.
    En l’absence de possibilité d’inactivation sur place, les déchets solides pourront par exemple être placés dans des containers adaptés, verrouillables et avec un étiquetage mentionnant qu’il s’agit d’OGM, et éliminés par un prestataire de service agréé pour l’élimination des déchets biologiques infectieux (DASRI), ou éliminés par toute autre méthode proposée permettant une inactivation empêchant toute dissémination de l’organisme dans l’environnement.
  • Les déchets inactivés sont alors considérés comme des Déchets Industriels Banals (DIB) ou assimilables à des Ordures Ménagères (OM).

Confinement C2

  • Les déchets liquides doivent être inactivés dès leur production par un traitement physique ou chimique.
    Par exemple une procédure d'autoclavage comme celle décrite ci-dessus. L'autoclave doit être situé dans le même bâtiment (C2).
  • Les déchets solides doivent être placés dans des conteneurs étanches et inactivés par autoclavage.
  • Les déchets inactivés solides sont ensuite éliminés par la filière de conteneurs pour DASRI : enlèvement, transport jusqu’au lieu de traitement par un prestataire de service agréé, et réception d’un BSDAS (Bordereau de Suivi des Déchets d’Activité de Soin).

6. Ressources et références

6.1 - Publications juridiques

3.2 - Autres publications